Perle di agarosio magnetiche SweMagrose IDA-Co per la purificazione delle proteine ​​His-Tag

 

Nome del prodotto	Gatto. NO.	Spec.
Perle di agarosio magnetiche SweMagrose IDA-Co per la purificazione delle proteine ​​His-Tag	G3655-1ML	1 ml
	G3655-5ML	5 ml

 

 

Questo prodotto è preparato da sfere magnetiche di agarosio modificate da IDA e ioni di nichel chelanti. Può purificare in modo efficiente e rapido le proteine ​​​​marcate con l'istidina nei campioni biologici senza filtrazione centrifuga. L'operazione è semplice e adatta alla purificazione delle proteine ​​solubili dell'istidina tag espresse nel surnatante o nelle cellule di batteri, lieviti e cellule. Può anche essere combinato con apparecchiature di purificazione delle proteine ​​ad alto rendimento per lo screening e la separazione delle proteine.

Co2+ ha 4 ligandi e un adsorbimento meno non specifico, Ni2+ ha 6 ligandi e una forte capacità di legame proteico, per più proteine ​​​​bersaglio, puoi scegliere le nostre altre perle di agarosio magnetico SweMagrose IDA-Ni per His -Purificazione delle proteine ​​tag (G3654).

 

 

Spedire con ghiaccio bagnato; Conservare a 4 gradi, valido per 12 mesi.

 

 

Numero componente	Componente	G3655-1ML	G3655-5ML
G3655	Perle di agarosio magnetiche SweMagrose IDA-Co per la purificazione delle proteine ​​His-Tag	1 ml	5 ml
Manuale		1 pz

 

 

1. La configurazione dei vari reagenti può essere definita come segue. Gli utenti possono scegliere la quantità appropriata di sfere magnetiche e formula tampone in base alla situazione dei reagenti.

Componente	Volume
10×PBS (fosfato di sodio 200 mM, pH 7,4)	50 ml
10x tampone imidazolico (fosfato di sodio 200 mM, imidazolo 5 M, pH 7,4)	50 ml
Dispositivo di rimozione del cobalto (Tris-HCl 10 mM, NaCl 500 mM, EDTA 100 mM, pH 7,4)	10 ml
Soluzione di lavaggio alcalina (0,5 M NaOH, 2 M NaCl)	10 ml
href="javascript:;" Solfato di cobalto (100 mM CoSO4)	15 ml
Soluzione di conservazione (20% etanolo)	50 ml

 

2. Configurazione del buffer

Le prestazioni di legame della proteina bersaglio con le sfere chelanti di ioni metallici influenzeranno direttamente l'efficienza di purificazione della proteina bersaglio e vari tamponi influenzeranno anche il recupero e la purezza della proteina bersaglio in una certa misura. Pertanto, prima della purificazione delle proteine ​​su larga scala, gli utenti dovrebbero progettare i propri esperimenti per selezionare i tamponi adatti alla proteina bersaglio, inclusi il tampone di legame, il tampone di lavaggio e il tampone di eluizione. Il sistema tampone fornito di seguito è adatto per la purificazione della maggior parte delle proteine ​​tag dell'istidina per riferimento degli utenti.:

Tampone legante: fosfato di sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazolo 5 ~ 50 mM, pH 7,4

Tampone di lavaggio: fosfato di sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazolo 50 ~ 100 mM, pH 7,4

Tampone di eluizione: fosfato di sodio 20 mM, NaCl 500 mM, imidazolo 500 mM, pH 7,4

3. Trattamento del campione

a) E. coli, lievito e altre proteine ​​espresse a livello intracellulare: aggiungere 5~10 mL di tampone di legame per grammo di cellule, aggiungere un inibitore della proteasi (ad es. PMSF a una concentrazione finale di 1 mM), risospendere le cellule e lisare ultrasonicamente le cellule cellule in un bagno di ghiaccio, ovvero il campione di proteina grezza. Se il campione è troppo viscoso, è possibile aggiungere una quantità adeguata di nucleasi al campione grezzo secondo necessità e metterlo in ghiaccio per 30 minuti per degradare gli acidi nucleici. In alternativa, è possibile eseguire la centrifugazione del campione proteico secondo necessità.

b) Proteina espressa extracellulare: il campione di proteina grezza è stato ottenuto quando il surnatante di espressione extracellulare è stato diluito con una quantità uguale di tampone di legame.

c) Proteine ​​espresse intracellularmente in cellule animali: prelevare una quantità adeguata di cellule animali, lavare una volta con una quantità adeguata di PBS (auto-fornito), scartare il surnatante, risospendere con una quantità adeguata di tampone di legame contenente l'1% (v/v) di Triton X -100 o 1% (v/v) NP-40, aggiungere un inibitore della proteasi (ad esempio, PMSF a una concentrazione finale di 1 mM) e metterlo in ghiaccio per 10 minuti, quello è un campione di proteina grezza.

4. Legame della proteina bersaglio alle sfere magnetiche:

a) Sospendere 2 g di peso umido degli organismi con 10 mL di tampone di legame e, dopo la frammentazione e la lisi, un campione della proteina grezza target viene aggiunto a una provetta da centrifuga contenente biglie magnetiche pretrattate e la provetta viene posta in un miscelatore vortex e agitato per 15 s. Il campione di proteina grezza target viene quindi aggiunto a una provetta da centrifuga con sfere magnetiche pretrattate.

b) Posizionare la provetta da centrifuga su un miscelatore rotante per 20-30 minuti a temperatura ambiente (se necessario, può ruotare e mescolare per 1 ora a una temperatura bassa di 2-8 gradi per prevenire la degradazione della proteina target) .

c) Posizionare la provetta da centrifuga sul separatore magnetico per la separazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga per i successivi test e rimuovere la provetta da centrifuga dal separatore magnetico per le successive fasi di lavaggio.

5. Lavaggio delle perle magnetiche:

a) Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio alla provetta da centrifuga contenente le biglie magnetiche, ruotare delicatamente la provetta più volte per risospendere le biglie, separarle magneticamente e trasferire la soluzione di lavaggio in una nuova provetta da centrifuga per il campionamento. Ripetere questa procedura una volta.

b) Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio alla provetta da centrifuga contenente sfere magnetiche per risospendere le sfere, trasferire la sospensione di sferette in una nuova provetta da centrifuga (per evitare la contaminazione delle proteine ​​target da parte di proteine ​​adsorbite in modo non specifico sulla parete della provetta da centrifuga originale ), separare magneticamente e pipettare il surnatante nella provetta di raccolta del tampone di lavaggio.

6. Eluizione della proteina target

a) Gli utenti possono regolare la concentrazione della proteina target modificando il volume di eluizione secondo necessità. Aggiungere 2-10 mL di tampone di eluizione, girare delicatamente la provetta più volte per sospendere le sfere, separare magneticamente le sfere e raccogliere l'eluato in una nuova provetta da centrifuga, che è il campione di proteina bersaglio purificata.

a) Se necessario, ripetere i passaggi precedenti una volta per raccogliere il campione in una nuova provetta da centrifuga per verificare se la proteina target è completamente eluita.

b) Rilevare la proteina bersaglio mediante SDS-PAGE o Western blotting. Se è necessario misurare la concentrazione proteica, è possibile utilizzare il tampone di eluizione per azzerare la concentrazione oppure utilizzare la dialisi o l'ultrafiltrazione per rimuovere l'imidazolo e quindi misurare la concentrazione.

7. Post-elaborazione della perla magnetica

a) Aggiungere 5 ml di tampone di eluizione alla provetta da centrifuga contenente le sfere magnetiche, girare la provetta su e giù più volte per sospendere le sfere, separarle magneticamente e rimuovere il surnatante.

b) Ripetere i passaggi precedenti due volte.

c) Aggiungere 5 mL di ddH O alla provetta da centrifuga contenente le biglie magnetiche, girare la provetta su e giù più volte per sospendere le biglie, separarle magneticamente e rimuovere il surnatante.

d) Ripetere i passaggi precedenti due volte.

e) Aggiungere la soluzione di conservazione alle sfere magnetiche per ottenere un volume totale di 5 ml, conservare a 2-30 gradi (per la conservazione a lungo termine, posizionare a 2-8 gradi) e può essere utilizzata per successiva purificazione della stessa proteina.

8. Rigenerazione del cordone magnetico

Quando le sfere magnetiche vengono utilizzate continuamente per 3 o più volte, la capacità di legare le proteine ​​bersaglio può essere significativamente ridotta e si consiglia di eseguire il processo di rigenerazione delle sfere magnetiche. Prendiamo come esempio 5 ml di sospensione di sfere magnetiche al 10% (v/v) per illustrare in dettaglio l'operazione di rigenerazione delle sfere magnetiche.

a) La sospensione di sfere magnetiche è stata separata magneticamente, rimuovere il surnatante e rimuovere la provetta da centrifuga dal separatore magnetico, aggiungere 5 ml di ddH2O alla provetta da centrifuga e girare la provetta su e giù più volte per risospendere le sfere magnetiche , separati magneticamente e rimuovere il surnatante.

b) Aggiungere 5 ml di solvente per cobalto, girare la provetta da centrifuga su e giù più volte per risospendere le sfere magnetiche, ruotare e miscelare per 5 minuti a temperatura ambiente, separare magneticamente e rimuovere il surnatante. Ripeti questo passaggio una volta.

c) Aggiungere 5 mL di ddH2O alla provetta da centrifuga contenente le sfere magnetiche, girare la provetta su e giù più volte per sospendere le sfere, separarle magneticamente e rimuovere il surnatante.

d) Trattamento alcalino (passaggio facoltativo): aggiungere 5 mL di tampone di lavaggio alcalino, girare la provetta da centrifuga su e giù più volte per risospendere le sfere, ruotare e miscelare per 5 minuti a temperatura ambiente, separare magneticamente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 5 mL di ddH2O, girare la provetta da centrifuga su e giù più volte per risospendere le sfere, separarle magneticamente e rimuovere il surnatante. Ripetere la fase di lavaggio ddH2O 3-5 volte finché la soluzione di lavaggio non diventa neutra.

e) Aggiungere 5 mL di cloruro di nichel, girare la provetta da centrifuga su e giù più volte per risospendere le sfere, ruotare e miscelare per 20 minuti a temperatura ambiente, separare magneticamente e rimuovere il surnatante.

f) Aggiungere 5 mL di ddH2O e girare la provetta da centrifuga su e giù più volte per risospendere le sfere, separarle magneticamente e rimuovere il surnatante. Ripeti questo passaggio 4 volte.

g) Aggiungere la soluzione di conservazione alle sfere magnetiche per ottenere un volume totale di 5 ml e conservare a 2-30 gradi (per la conservazione a lungo termine, posizionare a 2-8 gradi).

 

 

1. Questo prodotto è conservato in etanolo al 20% e deve essere sostituito prima dell'uso.

2. Non congelare o asciugare le perle, poiché ciò potrebbe comprometterne l'utilizzo finale.

3. Utilizzare con una cornice magnetica corrispondente.

 

Solo per uso di ricerca. Non adatto all'uso in procedure diagnostiche o terapeutiche!

 

 

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