Kit per la rilevazione quantitativa delle proteine ​​BCA

I metodi Bradford e BCA sono i metodi più comunemente utilizzati per la determinazione quantitativa della concentrazione proteica. Il kit di rilevamento quantitativo delle proteine ​​BCA è una formulazione compatibile con i detergenti a base di acido bicinconinico (BCA) per il rilevamento colorimetrico e la quantificazione delle proteine ​​totali. Questo metodo combina la ben nota riduzione di Cu2+ a Cu+ mediante proteine ​​in un mezzo alcalino (reazione del biureto) con il rilevamento colorimetrico altamente sensibile e selettivo del catione rameoso (Cu+) utilizzando un reagente unico contenente acido bicinconinico . Il prodotto di reazione di colore viola di questo test è formato dalla chelazione di due molecole di BCA con uno ione rameoso. Questo complesso solubile in acqua presenta una forte assorbanza a 562 nm che è quasi lineare con l'aumento delle concentrazioni proteiche in un ampio intervallo di lavoro (50–2000 µg/mL).

Questo metodo non è influenzato dalle sostanze chimiche e dall'elevata concentrazione di detergente nella maggior parte dei campioni, inclusi 5% SDS, 5% Triton X-100 e 5% Tween-20, 60, 80, ecc. Tuttavia, la chelazione e un agente riducente ad alta concentrazione influenzeranno i risultati del rilevamento. Pertanto, è necessario assicurarsi che non sia presente EGTA nel campione, che la concentrazione di EDTA sia inferiore a 10 mM e che la concentrazione di DTT e -mercaptoetanolo sia inferiore a 1 mM. Se il campione contiene un agente chelante o riducente, prendere in considerazione il kit di rilevamento quantitativo delle proteine ​​Bradford (G2001).

Spedire a temperatura ambiente; Conservazione dello standard proteico (BSA) a 2-8 gradi, valido per 12 mesi. La soluzione standard proteica deve essere conservata a -20 gradi e utilizzata entro 6 mesi. I restanti reagenti vengono conservati a temperatura ambiente, validi per 12 mesi.

1. Preparazione della soluzione di conservazione dello standard proteico: aggiungere 1 ml di soluzione diluente dello standard proteico alla provetta dello standard proteico (BSA) e 25 mg di standard proteico vengono completamente sciolti per ottenere una soluzione di conservazione dello standard proteico con una concentrazione di 25 mg/ml. La soluzione standard per la conservazione delle proteine ​​può essere conservata a lungo a -20 gradi;

2. Preparazione della soluzione di lavoro standard di proteine: 25 mg/ml di soluzione di conservazione standard di proteine ​​viene diluita 50 volte con PBS o soluzione salina normale per ottenere una soluzione di lavoro standard di proteine ​​con una concentrazione finale di 0,5 mg/ml. Prestare attenzione al metodo del gradiente 10 volte per la diluizione per garantire la precisione.

3. Curva standard (procedura su micropiastra): la soluzione di lavoro standard della proteina è stata aggiunta alla piastra a pozzetti 96-a 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 μL, quindi la soluzione di lavoro con gradiente di cui sopra è stata reintegrata a 20 μL aggiungendo 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 e 0 μL con PBS o soluzione salina fisiologica per ottenere le curve di gradiente con le concentrazioni di proteine ​​a 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 e 500 ug/mL nel seguente ordine. Le curve di gradiente sono state ottenute nell'ordine di 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/mL.

4. Preparazione del campione da analizzare: il campione da analizzare viene diluito adeguatamente (attraverso il rilevamento pre-test, la concentrazione proteica del campione da analizzare rientra nell'intervallo della curva standard per garantire che i risultati del rilevamento siano affidabili) e pipettare 20 µl di ciascun campione nelle piastre a pozzetti 96-. Il campione da analizzare e la soluzione di lavoro standard proteica vengono diluiti con la stessa soluzione.

5. Preparazione della soluzione di lavoro BCA: miscelare 50 parti di reagente BCA con 1 parte di soluzione di solfato di rame (50:1, reagente BCA: soluzione di solfato di rame). La soluzione di lavoro BCA può essere conservata a temperatura ambiente e utilizzata entro 24 ore. Aggiungere 200 µ l della soluzione di lavoro BCA a ciascun pozzetto. Si consiglia di preparare quanto necessario per evitare sprechi.

6. Rilevazione: aggiungere 200 µL della soluzione di lavoro BCA a ciascun pozzetto e mescolare accuratamente la piastra su un agitatore per piastre per 30 secondi; Dopo aver coperto la piastra e incubato a 37 gradi per 30 minuti, la curva standard n. 0 è stata utilizzata come riferimento per misurare l'assorbanza a o vicino a 562 nm su un lettore di piastre. (Nota: può anche essere fatto reagire a temperatura ambiente per 2 ore o a 60 gradi per 30 minuti. Se la concentrazione proteica è bassa, si consiglia di reagire a 60 gradi)

7. Calcolo: la curva standard è stata disegnata con il gradiente del contenuto proteico (ug/mL) come ascissa e il valore di assorbimento come ordinata. In base al valore di assorbanza del campione da analizzare, la concentrazione proteica (ug/mL) del campione da analizzare nel pozzetto corrispondente può essere trovata sulla curva standard e quindi moltiplicata per il fattore di diluizione del campione si ottiene la proteina effettiva concentrazione del campione.

1. La determinazione della concentrazione proteica mediante il metodo BCA è fortemente influenzata dalla temperatura e dal tempo e il valore di assorbanza cambierà con il prolungamento del tempo o con l'aumento della temperatura. Se il tempo e la temperatura della reazione cromatica non possono essere controllati con precisione, si consiglia di creare una curva standard per ciascuna determinazione.

2. Quando si prepara la soluzione di conservazione standard delle proteine, è necessario garantire una dissoluzione sufficiente. Diluizione Si consiglia di diluire 10 volte con gradiente quando si prepara la soluzione di lavoro standard proteica. Non diluire 50 volte alla volta per evitare errori.

3. Per garantire la quantificazione delle proteine, è meglio scegliere la stessa soluzione tampone per l'estrazione del campione e la diluizione dello standard proteico per garantire le stesse condizioni di rilevamento. Se il buffer ha un valore di fondo elevato, si consigliano altri metodi.

4. Per la vostra sicurezza e salute, indossate occhiali, guanti o indumenti protettivi.

Solo per uso di ricerca!

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