2×Master Mix QPCR verde universale blu SYBR (con UDG)

 

Nome del prodotto	Gatto. NO.	Spec.
2×Master Mix qPCR universale blu SYBR Green (con UDG)	G3328-01	1 ml
	G3328-05	5×1 ml
	G3328-15	15×1ml

 

 

Questo prodotto è una premiscela 2× specializzata per reazioni qPCR che utilizzano il metodo di fluorescenza chimerica SYBR Green I. L'uso della Taq DNA polimerasi racchiusa in anticorpi in combinazione con UDG (uracile-DNA glicosilasi) e dUTP riduce efficacemente la formazione di dimeri di primer, aumenta la specificità e migliora la sensibilità da un lato e previene la contaminazione incrociata causata dai prodotti di amplificazione della PCR d'altro canto, con conseguente quantificazione più accurata del gene bersaglio. Nel frattempo, questo prodotto contiene uno speciale colorante di riferimento passivo ROX e un colorante tracciante additivo per visualizzazione blu, che può essere applicato a tutti gli strumenti qPCR, senza la necessità di regolare la concentrazione di ROX su strumenti diversi. Viene fornito anche il diluente modello giallo. Quando il modello viene diluito con il diluente modello giallo e aggiunto alla premiscela di reazione blu, il colore cambia da blu a verde, che può svolgere un ruolo tracciante nel processo di preparazione del sistema di reazione, prevenendo omissioni o aggiunte errate. Gli spettri di questo colorante blu e giallo non si sovrappongono a quelli del colorante qPCR e non influenzano i risultati della reazione.

 

 

Spedire con ghiaccio bagnato; conservare a -20 gradi al riparo dalla luce, valido per 12 mesi.

 

Numero componente	Componente	G3328-01	G3328-05	G3328-15
G3328-1	2×Master Mix qPCR universale blu SYBR Green (con UDG)	1 ml	5×1 ml	15×1ml
G3328-2	40×tampone di diluizione del modello giallo	1 ml	1 ml	1 ml
Manuale		1 copia

 

 

1. (Facoltativo) Diluizione del modello

Il tampone campione giallo viene fornito a una concentrazione 40X per la diluizione del modello di DNA, che può determinare con precisione se il modello è stato aggiunto alla soluzione di reazione qPCR mediante il cambiamento di colore del liquido. Prendendo come esempio il sistema di reazione qPCR da 20 μL, in base alla quantità di modello di diluizione aggiunto nella soluzione di reazione qPCR da 20 μL, il metodo di diluizione corrispondente del modello originale può essere fatto riferimento alla tabella seguente (prendendo il modello originale diluito a 100 μL come esempio):

Aggiungere il modello diluito alla soluzione di reazione qPCR da 20 μL (μL)	1	2	3	4	5	6	7	8
Aggiungere il tampone di diluizione del modello GIALLO 40x al sistema di diluizione del modello da 100 μL (μL)	50	25	16.7	12.5	10	8.4	7.2	6.3
Aggiungere il sistema di diluizione del modello da 100 μL al modello primario (μL)	x	x	x	x	x	x	x	x
Volume di aggiunta di nucleasi - Acqua libera (μL)	50-x	75-x	83.3-x	87.5-x	90-x	91.6-x	92.8-x	93.7-x

 

Ad esempio: 2μL di modello diluito devono essere aggiunti a 20 μL del sistema di reazione qPCR. Prendendo come esempio il sistema di diluizione del modello da 100μL. Se il volume del modello originale è 20μL, vengono aggiunti 25μL di tampone di diluizione del modello giallo 40x, quindi vengono aggiunti 55μL di acqua priva di nucleasi al volume totale di 100μL. Il tampone di diluizione del modello GIALLO 40x è ora 10x. Aggiungere 2μL del modello diluito in un sistema di reazione qPCR 20-μL e la concentrazione finale del tampone di diluizione del modello GIALLO 40× è 1x.

Nota: se la concentrazione del modello è troppo bassa, non è necessario diluirlo o non si desidera utilizzare il modello diluito con 40x YELLOW Template Dilution Buffer, è possibile omettere questo passaggio.

1. 2. Sistema di reazione qPCR consigliato:

Componente	20 µl di RXN	50 µl di RXN	Concentrazione finale
2×Master Mix qPCR universale blu SYBR Green (con UDG)	10 μL	25 μL	1×
Primer diretto (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Primer inverso (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Modellob	Variabile	Variabile	come richiesto
Acqua priva di nucleasi	Aggiungere a 20 µl	Aggiungere a 50 µl

 

a: Di solito, è possibile ottenere un buon effetto di amplificazione con la concentrazione finale di {{0}},2 μM. Quando le prestazioni della reazione sono scarse, la concentrazione del primer può essere regolata nell'intervallo di 0.2-1,0 μM.

b: La quantità di modello aggiunta varia a seconda del numero di copie del gene bersaglio e la quantità appropriata di modello aggiunta viene studiata mediante diluizione in gradiente. La migliore quantità di aggiunta di DNA modello nel sistema di reazione da 20 μL era inferiore a 100 ng. Quando come modello è stato utilizzato il cDNA (soluzione di reazione RT) della reazione RT-PCR, la quantità aggiunta non deve superare il 10% del volume finale della qPCR.

 

2. 3. Programma di reazione PCR (può essere adattato opportunamente in base agli strumenti):

A. Metodo in due fasi					B. Il metodo in tre fasi
palcoscenico	fare un passo	Numero del ciclo	Temp eratura	tempo	palcoscenico	fare un passo	Numero del ciclo	Temp eratura	tempo
Fase 1	Incubazione dell'UDG	1	50 gradi	2 min	Fase 1	Incubazione dell'UDG	1	50 gradi	2 min
Fase 2	predegenerazione	1	95 gradi	30 secondi	Fase 2	Predeg enerazione	1	95 gradi	30 secondi
Fase 3	denaturazione	40	95 gradi	15 secondi	Fase 3	denaturazione	40	95 gradi	15 secondi
	Ricottura /estensione		60 gradi	30 secondi		Ricottura		55-65 grado	10 secondi
						Estensione		72 gradi	30 secondi
Fase 4	Curva di fusione	1	Strumento impostazione predefinita		Fase 4	Curva di fusione	1	Strumento impostazione predefinita

 

a: Se è necessario migliorare la specificità dell'amplificazione, è possibile utilizzare la procedura in due fasi o la temperatura di annealing; Per migliorare l'efficienza dell'amplificazione, è possibile utilizzare una procedura in tre fasi o un tempo di estensione.

 

 

1. Se non è richiesta la tracciabilità del pipettaggio, è possibile omettere il modello diluito con il tampone di diluizione del modello giallo 40×.

2. Miscelare i reagenti prima dell'uso capovolgendoli delicatamente su e giù. Non vortexare e oscillare per evitare bolle.

3. I reagenti devono essere collocati sul ghiaccio durante la preparazione delle miscele di reazione.

4. Evitare la luce forte durante la preparazione delle miscele di reazione PCR a causa del colorante fluorescente SYBR Green.

5. Per la preparazione delle miscele di reazione è necessario utilizzare nuovi puntali monouso per evitare la contaminazione incrociata

6. Evitare cicli di congelamento-scongelamento del Master Mix e cercare di consumarlo entro un mese dallo scongelamento.

 

 

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, serie QuantStudio™, PikoRealTM Cycler.

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™,

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QPCR

Cefeide: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: serie Rotor-Gene®;

Roche: Serie LightCycler™;

Takara: serie di dadi termociclatori;

Analisi analitica: serie qTOWER;

Hangzhou Bori: dipartimento LineGene;

 

 

1. Si consiglia che la lunghezza del prodotto amplificato sia compresa tra 80-300 bp;

2. Lunghezza del primer: 18-25 bp;

3. Mantieni il contenuto G+C nell'intervallo del 40%-60%.

4. È preferibile che i valori Tm dei primer diretti e inversi non differiscano di più di 2 gradi, ed è meglio controllare il valore Tm a 58-62 gradi;

5. Casualità della distribuzione delle basi;

6. Tra i due primer non dovrebbero esserci più di quattro basi complementari o omologhe, altrimenti si formerà un dimero di primer e si dovrebbe evitare in particolare la sovrapposizione complementare all'estremità 3';

7. Si raccomanda che la base terminale 3' del primer sia G o C;

8. Nessun prodotto non specifico appare nell'esplosione NCBI.

 

 

Descrizione del problema	Possibili ragioni	Soluzioni
Al termine della reazione non è apparsa alcuna curva di amplificazione oppure il valore CT è apparso troppo tardi	La concentrazione del modello è troppo bassa	Ripetere l'esperimento per ridurre il multiplo di diluizione del modello e iniziare dalla concentrazione più alta quando la concentrazione del campione è sconosciuta
	Degrado del modello	Il modello è stato preparato nuovamente e l'esperimento è stato ripetuto
	Nel sistema sono presenti inibitori della PCR	Generalmente, il modello viene trasportato, il rapporto di diluizione del modello viene aumentato oppure il modello con elevata purezza viene preparato e ripetuto
	I primer potrebbero degradarsi	I primer che non sono stati utilizzati per molto tempo dovrebbero prima essere testati per l'integrità mediante elettroforesi PAGE per escludere la possibilità di degradazione
	Bassa efficienza di amplificazione	Aumentare la concentrazione del primer, provare una procedura di amplificazione in tre fasi o riprogettare il primer
	Il prodotto di amplificazione è troppo lungo	La lunghezza del prodotto di amplificazione è stata controllata nell'intervallo di 80-300 bp
Il controllo vuoto mostra il segnale	Inquinamento del sistema di reazione	Innanzitutto è necessario sostituire l'acqua di controllo del bianco. Se la stessa situazione persiste, è necessario sostituire i primer, gli aspiratori e le provette PCR oppure avviare una nuova Master Mix. Il sistema di reazione è preparato in un tavolo super pulito per ridurre l'inquinamento da aerosol
	Appare un'amplificazione non specifica come i dimeri dei primer	In genere, è normale che i prodotti di amplificazione compaiano nel controllo in bianco dopo 35 cicli, che devono essere analizzati con la curva di fusione. Riprogettare il primer, regolare la concentrazione del primer o ottimizzare la procedura di reazione PCR
La curva di fusione ha più picchi	Il design del primer è scadente	Il nuovo primer è stato riprogettato secondo i principi di progettazione dei primer
	La concentrazione del primer è troppo alta	Ridurre adeguatamente la concentrazione del primer
	È presente una contaminazione genomica nel modello di cDNA	La soluzione di RNA estratta viene digerita utilizzando enzimi del DNA, come dsDNasi, per rimuovere la contaminazione genomica o per progettare primer transintronici
Scarsa riproducibilità degli esperimenti	L'errore nell'aggiungere il campione è grande	L'uso di una pipetta accurata, con pipetta accurata con testa di aspirazione di alta qualità; Modello ad alta diluizione, aggiunta di modello di grande volume per ridurre l'errore di campionamento; Il volume di reazione di qPCR è stato ampliato
	La concentrazione del modello è troppo bassa	Ripetere l'esperimento per ridurre i tempi di diluizione del template
	Deviazione della temperatura in diverse posizioni dello strumento qPCR	Calibrare regolarmente lo strumento qPCR
La curva di amplificazione non è uniforme	Il segnale di fluorescenza è troppo debole, prodotto dopo la correzione del sistema	Assicurarsi che i coloranti premiscelati nel Master Mix non siano degradati; Sostituisci il segnale fluorescente per raccogliere materiali di consumo qPCR migliori
La curva di amplificazione si rompe o scivola	La concentrazione del modello era più alta e il valore dell'endpoint basale era maggiore del valore CT	L'endpoint di base (valore Ct -3) è stato ridotto e i dati sono stati rianalizzati
Le curve di amplificazione dei singoli pozzi sono improvvisamente scese bruscamente	Sono presenti bolle nella provetta di reazione	Assicurarsi che MIX sia completamente sciolto e non agitare e oscillare in modo uniforme; Dopo l'aggiunta del campione, le bolle vengono rimosse mediante centrifugazione con elastico leggero. Il tempo di pre-denaturazione è stato prolungato a 10 minuti per rimuovere le bolle

 

Solo per uso di ricerca!

 

 

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