2×In-Fusion Cloning Mix Plus

 

Nome del prodotto	Gatto. NO.	Spec.
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	G3351-20T	20 T
	G3351-100T	100 T

 

Il 2×In-Fusion Cloning Mix Plus offre una maggiore efficienza di clonazione rispetto alle generazioni precedenti di kit In-Fusion (G3350,2×In-Fusion Cloning Mix), in particolare per frammenti multipli. È progettato per la clonazione rapida e direzionale di uno o 2~5 frammenti multipli di DNA in qualsiasi vettore. Fonde i frammenti di DNA (ad esempio, inserti generati dalla PCR e vettori linearizzati) in modo efficiente e preciso riconoscendo le sovrapposizioni di 15-25 bp alle loro estremità. Queste sovrapposizioni di 15-25 bp possono essere progettate progettando primer per l'amplificazione delle sequenze desiderate. L'inserimento simultaneo di più frammenti semplifica notevolmente le fasi sperimentali, migliora l'efficienza della clonazione e fa risparmiare tempo.

 

1. Progettazione di primer a frammento singolo: sequenze di 15-25 bp coerenti con entrambe le estremità del vettore linearizzato sono state introdotte nell'estremità 5' del primer di amplificazione dell'inserto. Progetta il diagramma seguente:

2. Progettazione di primer multiframmento: i principi di progettazione dei primer su entrambe le estremità del vettore sono gli stessi dei primer a frammento singolo. Il principio di progettazione della zona di ripristino tra i primer dei frammenti è il seguente: C'è una sovrapposizione di 15-25 bp tra il primer inverso del frammento 1 e il primer diretto del frammento 2. Il primer inverso per il frammento 1 include la regione sovrapposta e il primer specifico del frammento regione del primer, il primer diretto per il frammento 2 include la regione sovrapposta e la regione del primer specifico diretto, e così via (le regioni sovrapposte sono mostrate in rosso). Per migliorare l'efficienza, le regioni di sovrapposizione tra i frammenti possono essere aumentate e i loro valori Tm sono garantiti coerenti. Il disegno è il seguente:

 

 

Spedire con ghiaccio bagnato; memorizzato a -20 grado, valido per 12 mesi.

 

 

Componente	G3351-20T	G3351-100T
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	100 μL	5 x 100 μL
pUC19 (linearizzato, vettore di controllo, 5 ng/μL)	10 μL	10 μL
Inserto di controllo (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
Manuale	Una copia

 

 

Eseguire la reazione di legatura

1. In una provetta per microcentrifuga da 1,5-ml autoclavata, aggiungere quanto segue (si consiglia il sistema di reazione 10-uL):

Componente	Volume
2×In-Fusion Cloning Mix Plus	5 μL
DNA vettoriale	X μL
Inserisci il DNA	Y μL
Acqua priva di nucleasi	Aggiungere a 10 µl

 

2. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente per portare il contenuto sul fondo della provetta.

3. Per le reazioni di ricombinazione a frammento singolo, incubare a 50 gradi per 15 minuti; Per la ricombinazione multiframmento, incubare a 50 gradi per 30 minuti.

 

NOTA:Per 3-5 ricombinazione multiframmento, aumentare il tempo di reazione produrrà più colonie, ma non deve superare 1 ora).

4. Posizionare la provetta sul ghiaccio e procedere immediatamente a "Eseguire la reazione di trasformazione".

 

 

5. Aggiungere la reazione di ligazione appropriata all'E. coli chimicamente competente (come DH5, Top10, ecc.) e mescolare delicatamente. Non mescolare pipettando su e giù.

6. Incubare per 30 minuti in ghiaccio.

7. Sottoporre le cellule a shock termico per 30 secondi in un bagnomaria a 42 gradi.

8. Posizionare immediatamente le provette sul ghiaccio e incubare per 2 minuti.

9. Aggiungere 900 µl di terreno SOC o LB a temperatura ambiente. Tappare bene la provetta e agitarla orizzontalmente a 225 giri al minuto per 1 ora a 37 gradi.

10. Distribuire il volume richiesto della reazione di trasformazione su una piastra LB preriscaldata contenente gli antibiotici corrispondenti.

11. Incubare le piastre per una notte a 37 gradi.

 

 

Scegliere una singola colonia dalla piastra di trasformazione, analizzare i trasformanti mediante PCR delle colonie o digestione con enzimi di restrizione.

 

 

1. Il DNA del vettore e il DNA dell'inserto devono essere purificati tramite gel e analizzarne la qualità e la concentrazione mediante elettroforesi. L'acqua può essere omessa nella reazione di legatura se la concentrazione è bassa.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 gradi.

3. Si consiglia che il rapporto molare tra vettore e inserto sia 1:1~1:3; quando 2-3 frammenti sono collegati, il rapporto molare tra ciascun frammento è 1:1 e il sistema di reazione di legatura può essere ampliato in proporzioni uguali.

4. Se il volume totale del vettore e dell'inserto è superiore a 5 μL, è possibile ridimensionare il sistema di legatura a 20 μL.

5. Il volume del prodotto della ligazione non deve superare 1/10 del volume delle cellule competenti, altrimenti l'efficienza della trasformazione sarà notevolmente ridotta. Il volume del prodotto di ligazione e delle cellule competenti può essere aumentato in proporzioni uguali (ad esempio, 20 μL di sistema di ligazione trasformano 200 μL di cellule competenti).

6. La miscela di legatura universale 2× deve essere mantenuta a -20 grado fino a 5-10 minuti dall'uso e riportata immediatamente a -20 grado dopo l'uso. Si consiglia di congelare in aliquote per ridurre i cicli di congelamento-scongelamento.

7. Se per la trasformazione si utilizza l'elettroporazione, il DNA vettore e il DNA inserito devono essere purificati con il metodo su colonna o con il metodo di precipitazione con etanolo.

 

 

1. Il diagramma del processo sperimentale del costrutto plasmidico ricombinante

 

A. I frammenti di DNA inseriti sono stati ottenuti mediante amplificazione PCR: la sequenza omologa di 15-25 bp (verde e azzurro) dall'estremità del vettore linearizzato è stata introdotta nell'estremità dei primer forward/reverse del frammento target e il Le sequenze terminali 5' e 3' del prodotto amplificato erano completamente coerenti rispettivamente con le due sequenze terminali del vettore linearizzato.

B. Linearizzazione del vettore plasmidico: per ottenere vettori linearizzati sono state utilizzate l'endonucleasi di restrizione o la PCR inversa.

C. In-Fusion Cloning Plus: il trasportatore linearizzato e il frammento dell'inserto purificato e recuperato sono stati miscelati in proporzione e la reazione è stata completata a 50 gradi per 15 minuti.

D. Cellule trasformate: prodotti di reazione direttamente in cellule competenti di Escherichia coli, crescita di colonie monoclonali prelevarle dalla compressa per PCR, digestione enzimatica e sequenziamento di cloni positivi per screening sperimentale.

 

2. Mutazioni puntiformi singole del plasmide ricombinante costruiscono il diagramma del processo sperimentale

A. PCR a due frammenti (la PCR amplifica i frammenti di DNA su entrambe le estremità del sito di mutazione): sono stati disegnati primer complementari nel sito di mutazione (arancione) e primer su entrambe le estremità del gene mutante per introdurre sequenze omologhe all'estremità del vettore linearizzato 15-25 bp (verde e azzurro). Utilizzando diversi primer per l'amplificazione PCR, rispettivamente, mutazioni in due pezzi con le sequenze omologhe di due mutazioni genetiche del frammento inserito (includi), rispettivamente.

B. Linearizzazione del vettore plasmidico: per ottenere vettori linearizzati sono state utilizzate l'endonucleasi di restrizione o la PCR inversa.

C. In-Fusion Cloning Plus: il trasportatore linearizzato e il frammento dell'inserto purificato e recuperato sono stati miscelati in proporzione e la reazione è stata completata a 50 gradi per 15 minuti.

D. Cellule trasformate: prodotti di reazione direttamente in cellule competenti di Escherichia coli, crescita di colonie monoclonali prelevarle dalla compressa per PCR, digestione enzimatica e sequenziamento di cloni positivi per screening sperimentale.

 

3. Diagramma schematico del processo sperimentale di costruzione di plasmidi ricombinanti con inserimento multiframmento

A. Amplificazione PCR di frammenti aggiuntivi: le sequenze omologhe (contrassegnate in verde, blu scuro, giallo e azzurro) sono state aggiunte all'estremità 5' dei primer di amplificazione, in modo che ci fosse una sequenza omologa di 15-25 bp tra i frammenti prodotti di amplificazione e tra i prodotti di amplificazione e il vettore linearizzato. Sono state utilizzate diverse coppie di primer per amplificare i frammenti di DNA (contrassegnati in arancione, rosso e viola).

B. Linearizzazione del vettore plasmidico: per ottenere vettori linearizzati sono state utilizzate l'endonucleasi di restrizione o la PCR inversa.

C. In-Fusion Cloning Plus: il trasportatore linearizzato e il frammento dell'inserto purificato e recuperato sono stati miscelati in proporzione e la reazione è stata completata a 50 gradi per 15 minuti.

D. Cellule trasformate: prodotti di reazione direttamente in cellule competenti di Escherichia coli, crescita di colonie monoclonali prelevarle dalla compressa per PCR, digestione enzimatica e sequenziamento di cloni positivi per screening sperimentale.

 

Solo per uso di ricerca!

 

 

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